测序结果分析，以及RACE引物设计。求助呢

我的是用简并引物扩增的未知基因的高度保守区。现在已经拿到测序结果。我首先找到了上下游引物的位置，然后把质粒DNA截掉。拿高度保守区BLAST结果出现各种不同物种的的该基因，其中与模式生物的该基因100%相似。abi图谱看起来也比较靠谱。我还要做什么呢？是不是可以直接用该基因设计引物准备做RACE扩增全长了？请设计过RACE3‘和5’端特异性引物帮忙指点一下。另外我想说，我是一个小白，之前没什么实验基础。到现在拿到了保守区。从零基础一路以来，老师也没时间指导，都是靠自己在论坛里面提问。感谢那些帮助我的朋友。让我的实验如此的顺利。基本所有实验都一次性成功。一切尽在掌握中。谢谢

2026年09月20日 13:08

有2个网友回答

网友（1）：

先对实验对象进行诱导使你要的目的基因保证表达，然后提取总RNA，设计RACE特异性引物，5'RACE的特异性引物根据保守区靠近5‘端设计下游引物记得设计两条下游引物（模版序列的反向互补），一条比另一条更靠近保守区的上游，这两条最好相距几个碱基，还要保证和RACE上游引物的TM值相近。先用总RNA为模板使用5‘RACE试剂盒处理RNA5’帽子随后进行反转录，然后利用RACE上游引物和你设计的靠保守区下游的下游引物进行第一轮PCR。产物作为模版以RACE上游引物和你设计的靠保守区上游的下游引物进行第二轮PCR，以第二轮PCR产物进行克隆测序。
3‘RACE的特异性引物根据保守区靠近3’端设计上游引物1条（照抄模版序列）要保证和RACE下游引物的TM接近，利用3'RACE试剂盒反转录总RNA，然后使用你设计的上游引物和RACE下游引物中的Outer进行第一轮PCR，产物作为模版以你设计的上游引物和RACE下游引物中的Inner进行第二轮PCR，以第二轮PCR产物进行克隆测序。
两轮PCR即巢式PCR，目的是更有效的避免非特异扩增，因为你模版用的是总RNA

网友（2）：

测序结果分析你就得请教数据分析的专家撒，引物设计呢，当然是实验方面的咯。你得先有实验，才能在数据分析上面谈论问题啊。