siRNA在转染实验过程需要注意哪些事项？

在转染实验过程中，需要注意以下几点：A.纯化siRNA：在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15%20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸、小的寡核苷酸、蛋白和盐离子。

注意化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。

B.避免RNA酶污染：微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤、头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。

C.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性：通常，健康的细胞转染效率较高，此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。

D.避免使用抗生素：Ambion公司推荐从细胞种植到转染后72h期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。

E.选择合适的转染试剂：针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。

F.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件：对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48h后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平，过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。

G.通过标记siRNA来优化实验：荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。

1. 保证无RNA酶环境进行实验
环境和空气中含有大量的RNA酶，痕量的RNA酶即可对RRNA造成严重的降解。必须使用DEPC水或RNase-free水对RNA产品进行稀释。实验过程中，需避免RNA产品与人体皮肤或未经去RNA酶的实验耗材接触。因呼吸产生的气体和飞沫中均含有大量的RNA酶，所以必须佩戴口罩于超净工作台内进行实验操作。
2. 转染条件优化
优化转染条件非常重要，不同的细胞和实验中，建议都进行最佳siRNA浓度和转染试剂浓度优化。若转染试剂的转染效率不佳，可以尝试更换其他转染试剂，不同的转染试剂操作可能会有很大差异，必须严格按照说明书进行实验。有条件的话可以更换效率更高的转染方法，如电转或病毒转染。
3. 使用多条siRNA验证表型
建议使用两条或以上的siRNA来验证表型，用于排除非靶向效应导致的假阳性结果。现在越来越多期刊也倾向于要求使用多条siRNA验证表型。
4. 使用无抗培养基
转染6~8 h内，要使用无抗培养基。因为抗生素对细胞有毒性，会影响siRNA的递送效果。
5. 保证健康的细胞状态
使用传代50代内的细胞进行实验，传代太多的细胞转染效率会下降。转染前必须保证细胞处于健康的状态，状态不佳的细胞其转染效率通常也很低，且对干扰效率的检测也有很大的影响。
6. 阴性对照、阳性对照和荧光对照
使用乱序siRNA作为阴性对照，可以排除非靶向效应对实验数据的干扰。使用阳性对照（我司赠送GAPDH siRNA）可对实验流程进行质检，帮助快速分析实验中可能存在的问题。使用荧光对照可分析siRNA的转染效率，方便进行最佳实验条件摸索。

为了能在使用时有较好的转染效果，第一次建议使用用24孔板做，每孔2ul RFect,将最佳转染条件（siRNA与转染试剂的用量、比例）放大到对应的孔板;设置siRNA终浓度10nM,30nM,50nM,100nM四个梯度，每个梯度做2个复孔;用来稀释siRNA和稀释转染试剂的培养基必须是无血清培养基，血清的存在会干扰siRNA与转染试剂的混合，并且影响转染效率。