色谱柱柱效是评价色谱性能的重要指标,可通过理论塔板数或理论塔板高度衡量,一般塔板数越多或塔板高度越小,柱效越好。以下从柱效评价、提高液相和气相色谱柱柱效的方法进行介绍:
柱效评价方法仪器:高效液相色谱仪(带自动进样器或配置微量进样器)、分析天平。
试剂:苯、萘、联苯(均为分析纯)、甲醇(色谱纯)、纯净水。
色谱条件:色谱柱为C18,4.6×150mm,5μm;流动相是甲醇 - 水(80:20,v/v);检测波长254nm;流速1mL/min;柱温30℃;进样量10μL。
操作步骤:分别精密配制含苯、萘、联苯浓度均约1mg/mL的3份对照品溶液各10mL;分别精密吸取上述对照品溶液各2mL置于10mL容量瓶中,加流动相稀释并定容至刻度,摇匀得到混合对照品溶液;按照色谱条件操作进样,记录色谱图;计算各色谱峰的理论塔板数及各峰间分离度。
降低流动相流速,但会使分析时间延长。
增加色谱柱长度,不过分析时间会变长。
减小固定相颗粒度,但不能过分,否则色谱柱渗透率会减小。
选用低粘度流动相,利于快速传质,但不利于多组份分析。
适当提高柱温,可降低流动相粘度,但柱效和分离度也会随之降低。
尽量减小停滞流动相的体积,但会加快流动相流速。
柱效值不足以预测所有条件下的柱性能,高柱效不一定保证特定分离能力。
多个参数影响柱效测定,包括洗脱液成分和粘度及其线流速、测定塔板数所用溶质、温度、柱长、填料装填方式、颗粒度以及测量和计算方法,其中测量和计算方法对柱效值确定作用极大。
通常把色谱峰型看作正态曲线计算理论塔板数,计算柱效(以理论塔板数n为单位)的公式为:$n = (frac{t_R}{σ})^2=frac{16(frac{t_R}{ω_b})^2}{a}$
式中:$t_R$为色谱峰的保留时间;$σ^2$是以时间为单位测量色谱峰的偏差;$a$是和峰高(从测峰宽的基线量起)有关的常数;$ω_b$是峰宽,表示由色谱峰顶点与色谱峰两侧拐点处做切线与峰底基线相交两点间的距离。
不同峰型计算的理论塔板数值有差异,偏离正态模型的峰型(如“前延”或“拖尾”)越在峰高处测量,计算的理论塔板数值越大(准确性越低)。反映整个峰型(包括拖尾)且对色谱峰非对称性敏感的计算方法更适合保证定量重复性;若仅监测色谱柱使用过程中的柱效,可选择最简便的方法。
一般柱效不好,先排除其他问题,若都没问题则可能是柱子问题。
对于旧柱子,可反过来用小流速冲洗。
把柱头变色的填料挖掉,用同类新填料填充。
可正向冲洗色谱柱、反向冲洗色谱柱、超声清洗色谱柱筛板,若柱内死体积增加则需更换新柱。
柱效很低的色谱柱可尝试反冲,但流速不要设置太大;若反冲无效则需重新购买。
柱子重新活化可能提高柱效,但维持时间有限。
第一柱子温度能调高,第二可选柱子粒径小。
第三柱外体积小更妙,第四使用超纯的硅胶。
第五氘灯要选能量高,第六采用中空透光灯。
第七改变有机相比率,第八流动相pH可鼓捣。
第九可把键合相选挑,第十改变有机添加剂。
十一改变流动相配比,十二缩短检测响应时间。
常用载气有氢气、氮气、氩气、氦气。载气流速慢利于传质和组分分离,但分析时间长;流速快利于加快分析速度、减少扩散,但分离度降低。
各种载气在不同载气线速度下效率不同,氢气最佳线速度约50cm/sec,氦气约30cm/sec,氮气约15cm/sec。需检查色谱柱线速度和所需载气流速,确保组合产生最佳效率和最低板高度;同时要保证色谱柱尺寸在采集方法中设置正确。
进样口衬管:衬管的清洁度和失活是主要考虑因素,在分流进样中,衬管中活性部位的破坏可能影响分析物向色谱柱顶部转移,处理极性分析物时更明显。衬管清洁度不高或失活涂层消失可能导致峰拖尾或变宽,要确保衬管清洁,必要时定期更换。
进样手法:双手拿注射器,用一只手扶针插入垫片,注射大体积样品或柱前压力极高时,用右手大拇指按压住活塞顶部;让针尖穿过垫片尽可能深进入进样口,压下注射器活塞停留1秒钟,然后尽可能快而稳地抽出针尖(抽出的同时继续压住注射器活塞)。
进样时间:进样时间长短对柱效率影响大,若进样时间过长,会使色谱区域加宽而降低柱效率。对于冲洗法色谱,进样时间越短越好,一般必须小于1秒钟。
要点总结:维持足够长的不分流时间以转移所有分析物至色谱柱,但也要足够短以免溶剂从进样口缓慢流失导致色谱柱破坏;柱箱初始温度应至少比样品溶剂沸点低10℃;固定相极性应与样品溶剂极性相匹配,反之则应在进样口和分析柱之间留出至少1m长的未涂层保留间隙,否则会导致分析物峰形展宽,降低效率。
确保正确准备(切割和清洁)GC色谱柱并正确安装到GC进样口和检测器中。色谱柱切割不良会导致样品入口内部分析物转移变慢,可能导致峰变宽,还可能伴随峰分叉或拖尾。
色谱柱在进样口和检测器中的正确定位至关重要,入口色谱柱位置影响分析物最佳转移到色谱柱中,分流模式操作入口时尤为重要;色谱柱在检测器中的位置决定色谱柱出口与仪器内检测区域之间未清扫体积的量,载气存在分散展宽,空隙体积会对系统效率产生不利影响。
所有GC色谱柱都会污染且使用寿命有限,随着时间推移,色谱柱入口端可能被样品基质成分覆盖,固定相可能被破坏,形成降低分离效率的固定相区域。
通常通过修整较短色谱柱并重新安装可解决此问题,修剪时要保证恢复良好性能且修剪量最少,若进行重大修剪,要调整仪器内色谱柱长度以确保保留时间重现性和正确的载气线速度。
在载气供应管线中安装气阱可确保色谱柱寿命,适当样品预处理(分析前制备清洁样品)可延长色谱柱使用寿命、减少进样口维护操作。
气化室温度:取决于样品的化学和热稳定性、沸程范围、进样口类型等。合适的气化室温度能保持样品瞬间完全气化且不引起样品分解。温度过低,气化速度慢,使峰形不规则,出现平头峰或伸舌峰;温度过高使出峰数目变化,产生前延峰,甚至样品分解。
选择方法:气化室温度比柱温高50 - 100℃或比样品组分中最高沸点高50 - 70℃较为合适。不当的温度程序会造成不良分离,初始柱箱温度和分批进样的保持时间很重要。对于分流进样,初始温度应比色谱图中第一种组分的洗脱温度低45℃左右(典型值为50℃至色谱柱的梯度上限,每分钟10℃),初始保留时间需通过反复试验确定。
峰的正确“建模”取决于跨峰捕获的数据点数量,对于高效技术(如毛细管气相色谱仪),要特别注意检测器采样频率,质谱检测器尤其如此,其固有采样频率往往较低,尤其是在全扫描模式下。
若检测器仅捕获跨越峰的几个数据点,尤其是当峰顶点被检测器遗漏时,峰看起来可能比实际宽。要按照制造商说明为使用中的检测器找到最佳采样频率,建议在新色谱柱保留常规方法的参考色谱图作为评估柱效随时间下降幅度的参考,使用系统适应性测试(SST)在分析前评估仪器性能,柱效评估通常是SST的考察指标之一。