为什么：非特异性染色多，特异性染色不出来

（一）造成非特异性染色的主要因素
组织的非特异性染色的机制很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：
1．一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍生物，而不能被透析除去。
2．抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
3．除去检测的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原，可与相应抗体结合。
4．某些抗原性物质从组织中难于提纯，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体。
5．抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
6．荧光素不纯，标本固定不当等。
（二）消除非特异性染色的方法
消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法。Casella GT（2004）报道的在石蜡切片降低与醛固定有关的自发荧光方法是，抗原修复后组织立即浸入0.1%硼氢化钠（PBS配）室温30分钟，然后水漂洗5分钟。为了降低色素如血红蛋白、脂褐质的自发荧光，切片浸入过滤后的0.5%苏丹黑（Sudan black，70%乙醇配制）室温5分钟然后自来水流水冲洗3分钟。我们认为这种方法比较简便、实用。其他可以考虑的方法有以下几种：
1．动物脏器粉末吸收法
常用肝粉，其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg，在离心管中充分混匀，室温中振动2小时，4℃中过夜，再搅拌10分钟，高速（3000～15 000r/min）离心30分钟，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15 000r/min）30分钟，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。
肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。
用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水漂洗2～3次，12 000r/min离心沉淀10分钟，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。
2．荧光抗体稀释法
先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
3．伊文氏蓝（Evans blue）衬染法
用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/L PBS（pH 7.2）稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%。

荧光原位杂交方法是一种物理图谱绘制方法，使用荧光素标记探针，以检测探针和分裂中期的染色体或分裂间期的染色质的杂交。
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料.FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析.FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术.