利用纯化的总mRNA在反转录酶作用下合成互补的DNA即cDNA,再按上述构建基因文库的类似方法对cDNA片段进行克隆,由此获得的克隆总称为“cDNA”文库。
若提取的是某种特异的mRNA,而非总的mRNA,则由此构成的克隆即为相应于该种特异基因的cDNA克隆。cDNA文库和基因文库的不同之处在于,cDNA文库除去了mRNA拼接过程中除去的内含子等成分,便于DNA重组的使用,其复杂性比基因文库低得多。由于cDNA文库要比基因组DNA文库小,因此筛选起来很方便,已成为从真核生物细胞中分离纯化目的基因的常规方法。